不同组织来源的人诱导多能干细胞破骨细胞分化方案的比较

　　

　　

　　自从被发现以来，诱导多能干细胞(iPSCs)已经被广泛分化成各种各样的细胞类型。然而，将多能干细胞分化为破骨细胞的研究非常有限。虽然已经发表了几种分化方案，但仍不清楚哪种方案或分化方法更适合破骨细胞的分化。

　　在这项研究中，我们比较了外周血单核细胞(PBMC)衍生的iPSC系与成纤维细胞衍生的iPSC系在基于胚状体或基于单层分化策略下的破骨细胞发生能力。两种细胞系和分化方案都研究了它们产生破骨细胞的能力及其固有的稳健性和易用性。使用碱性磷酸酶染色评估两种细胞系在无进料系统繁殖时保持未分化的能力。然后用流式细胞术评估中胚层分化和造血祖细胞的特征。最后，以骨吸收活性、组织蛋白酶K和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)表达为基础，评估破骨细胞产量和功能。在整个分化阶段使用qRT-PCR验证结果。

　　基于胚状体的分化产生CD45+、CD14+、CD11b+亚群，这些亚群又分化为具有TRAP阳性、Cathepsin K表达和矿物质吸收能力的破骨细胞。这与使用哪个iPSC系无关。基于单层的分化产生的造血细胞数量较少，这些造血细胞主要是CD34+，随后不会分化成破骨细胞。

　　本研究的结果表明，结合基于胚状体的分化方法，破骨细胞从iPSCs中成功分化，而基于单层的方法不能产生破骨细胞。在PBMC和成纤维细胞衍生的iPSC系之间，破骨细胞的分化没有观察到差异。

　　自从Shinya Yamanaka在2006年发现体细胞重置为胚胎样状态以来[1]，诱导多能干细胞(iPSCs)在再生医学、疾病建模和药物发现领域开辟了以前不可想象的可能性[2]。正如后来建立的那样，通过转染所谓的山中因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)来创建这些细胞，使它们能够分化成所有三个胚层，并随后分化成许多终末分化的细胞类型[3,4,5,6,7,8,9,10]，从而证明了它们的多能性。因此，iPSCs提供了创造任何可想象的细胞类型以自体方式使用的可能性[11,12]。尽管在临床翻译方面仍然存在挑战和考虑[11]，但自体使用的可能性可以治疗目前无法治疗的疾病[13,14,15]。

　　自体使用iPSCs的一种情况是利用工程破骨细胞(OCs)作为治疗骨病[16]和异位钙化疾病[17,18,19]的策略。我们的研究小组之前开发了工程小鼠OCs (iRANK细胞)，方法是用含有核κB细胞内受体激活因子(RANK)信号域的病毒构建体转染OC前体，该信号域与融合蛋白(FKBP12)相连接，该融合蛋白为二聚化化学诱导剂(CID)提供结合位点，从而允许独立于核因子κB配体受体激活因子(RANKL)和骨保护素(OPG)的药物控制细胞分化[17,20]。这些工程化的iRANK细胞已被证明在异位骨化的控制吸收[17,21]、坏死骨[22]等应用中是有效的，甚至可以设想更多潜在的应用。此外，iRANK细胞也被用于涉及OCs的疾病的疾病建模[22]。

　　就从小鼠细胞向人类细胞的转化而言，一个强大的人类OCs来源不仅对于人类iRANK细胞的产生是必要的，而且对于需要人类OCs的其他应用也是必要的[23,24]。虽然CD34+外周血单个核细胞(PBMCs)仍被许多人用作OCs的主要来源[25,26,27]，但从患者身上采集的数量少，加之无法在体外扩增[28,29]，限制了其潜在的自体应用。另一方面，iPSCs可以克服细胞数量限制的问题，因为它们可以在体外无限扩增，从而可以扩大OC的生产规模。此外，iPSCs可以从多种组织来源中产生，并且不需要从患者身上抽取大量血液。

　　迄今为止，已经有几个iPSC系成功分化为OCs[30,31]。然而，从iPSCs生成人类oc的整个过程可能存在很大差异[32]。从iPSC创建的载体[33,34,35]和iPSC扩展所使用的协议[36]开始，可能会出现差异。为了生成OC, iPSCs必须经过中胚层和造血分化，然后是终末OC分化[10,37,38,39]。中胚层和造血分化的不同方法已经发表。一种方法涉及单细胞iPSC悬浮液的创建，该悬浮液用于创建小的球形胚状体样结构，据说可以模拟着床后胚胎发育的早期阶段[4,40]。另一种方法是利用单层iPSC集落启动中胚层诱导和造血分化[41,42]。这两种方法都会产生产生造血祖细胞(HPCs)的细胞形成复合物，但用于分化的细胞因子不同。虽然已经发表了几种分化方案，但目前尚不清楚哪种方案或分化方法更适合人类oc的高效和稳健分化。

　　在这项研究中，我们比较了pbmc衍生的iPSC系和成纤维细胞衍生的iPSC系(pbmc衍生的和成纤维细胞衍生的)，并结合了基于胚状体(EB)[31]或基于单层(MB)[37]的分化方案。研究了两种细胞系和分化方案产生OCs的能力及其固有的稳健性和易用性。首先，评估了两种细胞系在无喂食系统中繁殖时保持未分化的能力。接下来是评估中胚层分化和分化策略下产生的造血祖细胞的特征。最后，评估和比较基于吸收活性、Cathepsin K和TRAP表达的OC收率和OC功能。

　　iPSC文化

　　比较了两种不同组织来源的iPSC细胞系OC的增殖和分化情况。MCND-TENS2，来自健康供体的外周血单核CD34+/CD38?细胞衍生的iPSC细胞系[37](来自美国马里兰州Bethesda的NIH国家心肺血液研究所;注册于https://hpscreg.eu/cell-line/RTIBDi001-A)与GM28404*B进行比较，GM28404*B是一种纤维母细胞衍生的iPSC系，记录来自“明显健康的个体”(来自美国新泽西州Camden的Coriell研究所细胞库;注册网址:https://www.cellosaurus.org/CVCL_C0M4)。这两种细胞系都是使用仙台病毒重编程试剂盒创建的[37,43]。解冻后，用mTeSR Plus (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)在Cultrex基底膜提取物(R&D Systems, Minneapolis, USA)包被的6孔板上培养细胞，在37°C和5% CO2中孵育。解冻时共使用10μM rho相关的含ROCK蛋白激酶抑制剂Y-276432，以提高细胞存活率。每隔一天进行一次媒体更改。使用5u /mL disase (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)以70-80%的合流率传代iPSCs。

　　中胚层诱导，造血分化，破骨细胞分化

　　在本研究中，将R?ssler等人[31]发表的细胞因子定义的分化方案与市售的分化试剂盒(STEMdiff造血试剂盒，StemCell Technologies, Vancouver, Canada)进行了比较，该试剂盒使用来自不同组织来源的上述iPSC系。两种细胞系在传代27时均进行中胚层诱导。

　　根据R?ssler等人的研究[31]，将单细胞悬液接种于圆底超低附着96孔板中，细胞密度为1.25 × 104个细胞，100μL mTeSR Plus中添加50 ng/mL人骨形态发生蛋白4 (BMP4) (StemCell Technologies，温哥华，加拿大)，50 ng/mL人血管内皮生长因子-165 (VEGF165) (StemCell Technologies，温哥华，加拿大)，20 ng/mL人干细胞因子(SCF) (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)， 10 μM ROCK抑制剂Y-27632 (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)。随后，96孔板在100 × g下离心3 min, 1、2天后分别换半培养基。中表皮诱导4天后，胚状体转移到6孔板上，在X-VIVO 15培养基(瑞士巴塞尔龙沙Bioscience Lonza)中进一步分化，培养基中添加2 mM超谷草胺(瑞士巴塞尔)，55 μM 2-巯基乙醇(ThermoFisher, Waltham，美国)，25 ng/mL人白细胞介素3 (IL-3) (StemCell Technologies，温哥华，加拿大)和100 ng/mL人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF) (StemCell Technologies，温哥华，加拿大)。5天后更换3 mL的全培养基。分化10天后，收获悬浮细胞用于进一步的OC分化。

　　使用STEMdiff造血试剂盒[37](StemCell Technologies, Vancouver, Canada)按照制造商说明进行MB分化。简而言之，将16-40个细胞聚集体接种到每个涂有Cultrex基膜提取物的12孔板上，用培养基A(含bFGF、BMP4、VEGFA)处理3天[37]，连续用培养基B(含bFGF、BMP4、VEGFA、SCF、Flt3L、TPO)处理10天[37]。在周期结束时收获悬浮细胞，用于进一步的OC分化。

　　造血分化后，将细胞转移到2 × 105个/cm2的6孔板上，在添加10%热灭活胎牛血清(FBS)和50 ng/mL人M-CSF的α - mem(瑞士巴塞尔Lonza Bioscience)中培养3天，然后在添加10%热灭活胎牛血清、50 ng/mL人M-CSF和70 ng/mL人RANKL (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)的α - mem中培养7天。每2-3天更换一次培养基。最后用α - mem加10%热灭活胎牛血清和80 ng/mL人RANKL处理2天，完成OC分化。

　　下面概述了整个分化过程以及两种分化方法(EB和MB)的比较(图1)。

　　图1

　　

　　分化过程示意图及基于胚状体(EB)和基于单层(MB)分化的比较。插图由Hannah和Alexander bl

　　mke使用Affinity Designer 2.1.1绘制

　　酶染色

　　为了评估细胞扩增过程中自发分化的程度，两种iPSC细胞系在每次传代时都进行碱性磷酸酶(ALP)染色(Abcam, Cambridge, UK)，作为多能性的标记。此外，在整个分化过程中评估ALP的表达。为此，将细胞接种到8室载玻片上，以70-80%的合流度固定，并根据制造商的方案进行染色。平铺全孔图像使用倒置宽视场显微镜(DMI6000，徕卡，Wetzlar，德国)拍摄。

　　将M-CSF成熟的造血细胞接种到磷酸钙24孔骨吸收测定板(Cosmo Bio, Tokyo, Japan)上进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，以便使用TRAP染色试剂盒(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)评估破骨细胞的发生。染色按照制造商的说明进行。简而言之，用4% PFA固定细胞，洗涤，将染色混合物加入板中，在37℃下孵育20分钟。然后用甲基绿核染色剂(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)在室温下反染OCs 10分钟。图像采集采用徕卡DMI6000倒置显微镜相对比模式，平铺全孔图像分析细胞大小和多核使用ImageJ。

　　免疫细胞化学

　　在EB或MB诱导后进行免疫细胞化学(ICC)以评估中胚层分化，在RANKL治疗结束后进行免疫细胞化学(ICC)以评估OCs。

　　EB诱导后，细胞用4%多聚甲醛(PFA)固定，并用含有10%正常山羊血清(Abcam, Cambridge, UK)、0.3% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和1%牛血清白蛋白(BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的PBS阻断。阻断后，将胚状体与SOX1 (NL493偶联)和Otx-2 (nl557偶联)抗体孵育过夜以评估外胚层分化，Brachyury (nl557偶联)和HAND1 (nl637偶联)抗体孵育过夜以评估中胚层分化，或与GATA-4 (nl493偶联)和SOX17 (nl637偶联)抗体孵育过夜以评估内胚层分化(所有细菌层抗体均来自R&D Systems, Minneapolis, USA)(附加文件1:表S1)。所有细胞用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)反染色15分钟(R&D Systems, Minneapolis, USA)。使用徕卡SP8X共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)采集图像，并使用ImageJ进行分析。

　　OC分化后，用4% PFA固定细胞，用Triton X-100 (ThermoFisher, Waltham, USA)渗透30分钟，用正常山羊血清阻断60分钟。渗透和阻断后，OC用抗cathepsin K抗体(Abcam, Cambridge, UK)染色，再用Alexa 647偶联二抗(Abcam, Cambridge, UK)染色(附加文件1:表S1)。然后用tritc偶联的Phalloidin和DAPI核染色对细胞进行染色。如上所述获取图像并进行分析。

　　造血细胞的数量和活力

　　造血分化后，收集悬浮细胞，并使用伯爵夫人3细胞计数器(ThermoFisher, Waltham, USA)进行分析。在检测样品中加入台盼蓝后，测定细胞活力和细胞数量。

　　流式细胞术

　　通过收集单核细胞样悬浮细胞，用LIVE/DEAD Fixable Violet染色(ThermoFisher, Waltham, USA)染色，并使用TruStain FcX (biolgend, San Diego, USA)阻断Fc受体来评估造血分化。然后用4% PFA固定细胞(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, USA)，随后用一抗染色(附加文件1:表S1)对照CD34 (pe - cy7偶联)(BD, Franklin Lakes, USA)、CD43 (percp - cy5.5偶联)(BD, Franklin Lakes, USA)、CD45 (apc偶联)(BD, Franklin Lakes, USA)、CD14 (bv711偶联)(BD, Franklin Lakes, USA)、CD11b (pe - cy5偶联)(Biolegend, San Diego, USA)和CD265/RANK (pe偶联)(R&D Systems, Minneapolis, USA)，在4°C的PBS中添加0.09% (w/v)叠氮化钠(ThermoFisher, Waltham, USA)和1%热灭活FBS，孵育1h。如上所述进行数据采集和分析。用UltraComp eBeads (ThermoFisher, Waltham, USA)进行阳性对照和荧光补偿。在单线和活/死门之后使用同型控制进行门控。使用BD FACSymphony A3 (BD, Franklin Lakes, USA)获取数据，并使用FlowJo 10 (BD, Franklin Lakes, USA)进行分析。

　　矿物吸收试验

　　为了确定分化oc的矿物吸收能力，将HPCs镀在磷酸钙- 24孔吸收测定板上并如上所述进行处理。在终止OC分化后，使用5%漂白剂去除OC，并通过如上所述的平铺全井图像分析吸收面积。来源于人CD34+ PBMCs的OCs(健康供体，来自Fred Hutch, Seattle)作为阳性对照。除了使用相衬模式获取图像外，为了便于区分ImageJ中的吸收区域和未吸收区域，还使用荧光模式下的黄色通道拍摄了用于吸收区域定量的图像。

　　基因序列分析压力

　　根据制造商的协议，使用RNeasy试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)对两种iPSC系进行EB或MB方法在分化过程中的RNA提取和分离。简而言之，在细胞中加入裂解缓冲液，使用20G针头和注射器进行机械裂解。RNA提取后，利用自旋柱分离纯化RNA。使用NanoDrop (ThermoFisher, Waltham, USA)测定RNA浓度。使用Omniscript (Qiagen, Hilden, Germany)在37°C下，用250 ng RNA生成互补DNA (cDNA)，然后使用TaqMan定量反转录PCR (qRT-PCR)测定POU5F1, CSF1R, TNFRSF11A, NFATC1, CA2, MMP9的表达(附加文件2:表S2)。将基因表达水平归一化为18S核糖体RNA水平，并采用Ct法计算，以确定整个分化过程中的折叠基因表达。

　　统计分析

　　采用GraphPad Prism 9进行统计分析。数据以平均值±SD表示。除非个别实验另有说明，否则采用Tukey多重比较事后检验评估统计学显著性。校正后的p值p < 0.05被认为具有统计学意义。

　　摘要。

　　背景

　　结果

　　讨论

　　结论

　　数据和材料的可用性

　　缩写

　　参考文献。

　　致谢。

　　作者信息

　　道德声明

　　# # # # #

　　iPSCs在增殖过程中保持未分化，并在整个分化过程中保持ALP在中心位置细胞中的表达。

　　对PBMC和成纤维细胞衍生的iPSC系进行了ALP染色，并将其用作干细胞标记，以监测自发分化，并在中胚层诱导之前确认所述iPSC系的干性(图2)。两种细胞系在细胞繁殖过程中都表现出一致的ALP表达模式，而细胞集群周围的染色更加密集，如先前在其他地方描述的那样[44](图2A, B,G,H)。在采用EB分化(图2C,D,I,J)或MB分化方案(图2E,F,K,L)进行中胚层分化后，两种细胞系都保留了一定程度的ALP表达。与pbmc衍生的iPSCs(图2E)相比，在MB方案下分化的成纤维细胞衍生的iPSCs中观察到更高程度的ALP表达(图2K)。此外，在MB细胞形成复合物中观察到更高程度的大小和分布变异性(数据未显示)。造血分化后，细胞形成复合物在细胞形成复合物内最中心位置的细胞中仍保持一定水平的ALP表达(图2D、F、J、L中的箭头)。在EB方案下分化的pbmc衍生的iPSCs的细胞形成复合物(图2D)似乎比成纤维细胞衍生的EB细胞形成复合物更能维持其结构(图2J)。正如预期的那样，在两种分化方案中，在造血分化后观察到大量ALP阴性细胞(图2D,F,J,L中的空箭头)。

　　图2

　　

　　碱性磷酸酶(ALP)在iPSC细胞系中中胚层和造血分化前和分化过程中的表达评估。3个重复的代表性图像显示了pmc衍生细胞系(a -F)和成纤维细胞衍生细胞系(G-L)的ALP染色菌落和细胞形成复合物，在扩增时显示ALP的高表达(a, B, G, H)。根据基于胚状体的(C, D, I, J)或基于单层的方案(E, F, K,L)，细胞形成复合物保留ALP表达，特别是在中心位置的细胞(实箭头)。造血分化后可观察到大量alp阴性细胞(空箭头)。比例尺=500μm

　　免疫细胞化学结合共聚焦显微镜对细胞形成复合物进行了评估，以评估中胚层诱导后的分化过程(图3)。如图所示，所有细胞形成复合物，来自pbmc衍生的iPSCs或成纤维细胞衍生的iPSCs，并根据EB或MB分化方案进行分化，表达了所有三种胚层的标记物。与成纤维细胞衍生的细胞系(图3G-L)相比，pbmc衍生的细胞系在EB(图3A-C)和MB分化方案(图3D-F)下，基于外胚层、中胚层和内胚层转录因子的表达，显示出更高的组织程度。与SOX1相比，两种细胞系和两种分化方案均显示外胚层标记物Otx-2的表达更高(图3A,D,G,J)。SOX17是一种内胚层标记物，在两种iPSC系中根据MB方案分化的细胞形成复合物中一致地集中表达(图3F和L)。pbmc衍生iPSC的EB细胞形成复合物表达中胚层标记物Brachyury(图3B)，而源自成纤维细胞衍生细胞系的EB细胞形成复合物表达低至不表达Brachyury(图3H)。

　　图3

　　

　　利用CLSM分析中胚层分化后细胞形成复合物。3个重复的代表性图像显示，pmc衍生的iPSCs (A-F)或成纤维细胞衍生的iPSCs (G-L)根据基于胚胎体的(EB)方案(A, B, C, G, H, I)或基于单层的(MB)方案(D, E, F, J, K, L)进行分化，并染色为外胚层(A, D, G, J)，中胚层(B, E, H, K)和内胚层标记物(C, F, I)，pbmc衍生的iPSCs的细胞形成复合物的表达模式比成纤维细胞衍生的iPSCs形成的复合物具有更高的组织程度。比例尺=300μm

　　造血分化后，收集由细胞形成复合物产生的悬浮细胞群，并分析其数量和细胞活力(附加文件3:图S1)。与本研究中使用的独立于iPSC系的MB方案相比，根据EB方案(附加文件3:图S1A)分化的细胞形成复合物中收获的细胞更多。

　　为了进一步表征收获的浮动细胞群，使用造血和单核细胞标记进行流式细胞术(图4)。此外，用抗RANK抗体对细胞进行染色，以研究RANK表达的早期差异是否可以解释细胞系和分化方案之间OC活性的差异。

　　图4

　　

　　流式细胞术评估造血细胞。A, D未分化的iPSCs作为标记表达的参考。B, C, E, F根据胚状体(EB)方案分化的造血细胞与基于单层(MB)的分化细胞(C, F)相比，后期造血标志物CD43和CD45 (B, E)的表达更高。此外，单核细胞标志物CD14和CD11b在EB组(B, E)中升高。两种分化方案之间未观察到RANK表达差异

　　作为阴性对照的未分化iPSC(图4A和D)显示，与成纤维细胞衍生的iPSC系相比，pbmc衍生的iPSC系中CD34+亚群更大。此外，两个未分化的iPSC群体产生了CD265+亚群体的一小部分。

　　与MB分化的细胞相比，EB分化的细胞产生更大的CD43+和CD45+群体(图4B和D)，而MB分化导致更大的CD34+群体(图4C和F)。此外，根据EB方案分化的漂浮造血细胞在两种iPSC系中都有更大的单核细胞群体(CD14+和CD11b+细胞)(图4B和E)。两种分化方案或细胞系之间没有观察到RANK表达的差异。

　　OC分化后，对细胞进行Cathepsin K(蓝绿色)和F-actin(红色)染色，并用核DAPI染色(蓝色)反染色(图5)。根据EB方案分化时，成纤维细胞和pbmc衍生的iPSC系均显示出多个大的展开的多核细胞(图5A,B,E,F)。在两组中都观察到几个具有多达100个细胞核的大多核体(图5A和E中的实箭头)，而来自成纤维细胞的iPSC系的组织蛋白酶K(图5F中的箭头)似乎比来自pbmc的细胞系(图5B中的箭头)表现得更多。这两种细胞系在靠近核簇的地方都有最强的组织蛋白酶K信号。此外，不同程度表达Cathepsin K的单核细胞与大的多核细胞穿插在一起(图5A和E中的空箭头)。

　　图5

　　

　　CLSM对破骨细胞分化后细胞形态的评价。根据基于胚状体的(EB) (a, B, E, F)或基于单层的(MB)方案(C, D, G, H)分化的pbmc衍生的iPSC系a - D或成纤维细胞衍生的iPSC系(E - H)的造血细胞的代表性CLSM图像进一步进行破骨细胞分化，并进行Cathepsin K(蓝绿色)，F-actin(红色)和DAPI核染色反染(蓝色)。根据EB方案分化的细胞显示大的多核多核(A, E中的实箭头)，同时也显示Cathepsin K的表达(箭头尖端为B，F)。MB另一方面显示低分化细胞细胞的数量5核(实心箭头D)与stellar-like PBMC-derived iPSC线和细胞形态学的fibroblast-iPSC线(H雪佛龙箭头)。数量有限的细胞表达组织蛋白酶K中可以看到两组(箭头在D H)。单核细胞与某种程度的组织蛋白酶K表达式可以看到全组(空箭头,D, E,图像定量显示，EB和MB方案在破骨细胞数量(3个或更多细胞核)方面存在显著差异(I)。当EB方案与不同的iPSC系一起使用时，破骨细胞大小或细胞核数量无显著差异(J, K)。标尺:a, C, E, G=100μm, B, D, F, H=25μm。统计学采用方差分析和Tukey多重比较事后检验(I n=3个孔重复，J, K n=50个分析细胞，**p < 0.01， ***p < 0.001)。

　　根据EB方案分化的两种细胞系的相对同质性(图5A、B、E、F)与根据MB方案分化的PBMC和成纤维细胞来源的细胞系的不同外观形成对比(图5C、D、G、H)。在多个实验之间得出了类似的观察结果。首先，pbmc衍生的iPSCs仅显示少数多核细胞，每个细胞不超过5个细胞核(图5D中的实箭头)。在一些单核和多核细胞中观察到Cathepsin K的表达(图5D中的箭头)。虽然一些细胞呈扩散形态，但大多数细胞为单核细胞，呈星形或纺锤状外观(图5D中空箭头)。与pbmc衍生的细胞系相比，成纤维细胞衍生的iPSC细胞系(图5H)在OC分化后显示出具有明显恒星样表型的单核细胞。虽然大多数这些星形细胞似乎表达很少或不表达Cathepsin K(图5H中的箭头)，但用trtc偶联的Phalloidin可视化F-actin后，可以看到结构良好的F-actin细胞骨架结构(图5H中的v形箭头)。在该组中还观察到不同程度表达Cathepsin K的小单核细胞(图5H中空箭头)。图像定量证实了两种方案之间的显着差异(图5I)，同时显示根据EB方案(图5J和K)使用PBMC或成纤维细胞来源的细胞系分化的破骨细胞没有显着差异。

　　如图6所示，通过TRAP和甲基绿核反染色(图6B和F中的实箭头)确定，根据EB方案分化的两种iPSC细胞系在OC分化后都产生了大的、多核的OC(图6A、B、E、F)。TRAP通常用于染色OC，但也在白细胞中表达，下文将进一步讨论。在两组中都可以看到吸收坑(图6A和E中用白色虚线勾勒的边界)。与pbmc来源的细胞系相比，在EB方案下从成纤维细胞来源的细胞系分化的OCs更大，数量更多，TRAP染色也更密集。根据MB方案分化的两种细胞系(图6C,D,G,H)显示轻度染色的trap阳性单核细胞。与成纤维细胞来源的细胞系(图6G和H)相比，pbmc来源的细胞系(图6D)观察到单个核细胞的细胞密度较低。与图5G和H的发现类似，图6H再次显示了具有恒星样表型的TRAP?细胞(图6H中的空箭头)。

　　图6

　　

　　破骨细胞分化后细胞的TRAP染色与甲基绿核反染。根据基于胚状体(EB) (a, B, E, F)或基于单层(MB) (C, D, G, H)的方案进行分化的pbmc衍生的iPSC系a - D或成纤维细胞衍生的iPSC系(E - H)的a - H造血细胞被植入磷酸钙包被的孔中，并进一步接受破骨细胞分化条件。来自EB方案的细胞的代表性图像显示具有多个核的大型TRAP阳性细胞(A, B, E, F) (B, F中的实箭头)。两组中也可见吸收凹坑(A, E中的白色虚线)。来自MB方案的细胞没有产生破骨细胞。在成纤维细胞衍生的iPSC MB分化组中可以看到恒星状细胞形态的细胞(H中空箭头)。比例尺:a、C、E、G=250μm, B、D、F、H=50μm

　　总的来说，细胞形态学的评估以及组织蛋白酶K和TRAP的表达表明，当使用EB方案时，人类OCs发生了分化。

　　通过量化磷酸钙包被孔的吸收面积来评估OC的吸收活性(图7)。根据EB方案分化OC的孔在pbmc来源的细胞系(图7A)和成纤维细胞来源的细胞系(图7E)中都显示出清晰可见的吸收坑。然而，从成纤维细胞衍生的iPSC细胞系中产生的OCs的定量吸收坑面积显著高于从pbmc衍生的细胞系(36.9% vs. 57.2%， p < 0.05)。相比之下，根据MB方案进行OCs分化的井(图7C和G)几乎没有可见的吸收坑。

　　图7

　　

　　破骨细胞矿物吸收活性的评估与量化。根据基于胚状体(EB)的A、B、E、F或基于单层(MB)的方案(C、D、G、H)， pbmc来源的iPSCs (A - D)或成纤维细胞来源的iPSCs (E - H)的造血分化后，造血细胞在M-CSF中成熟，并在磷酸钙包被孔上用RANKL分化为OCs。与未分化的阴性对照(B)相比，使用EB方案从pbmc来源的iPSCs分化的破骨细胞在宽视场显微镜下在相衬模式下获得的平纹全孔图像上显示出清晰可见的吸收坑(B)。同样，使用EB方案分化的成纤维细胞来源的iPSCs的破骨细胞也显示出清晰可见的吸收坑，尽管总吸收面积E比阴性对照(F)大得多。与阴性对照(D, H)相比，根据MB方案分化的细胞在C、G两种细胞系中均未显示明显的吸收坑。比量表=1 mm。图像量化显示，根据EB方案分化的pbmc衍生的iPSC破骨细胞的吸收水平与从原代CD34+ pbmc分化的破骨细胞相当。用EB方法从成纤维细胞衍生的iPSC细胞系分化的破骨细胞中观察到最高水平的矿物吸收。定量证实，在根据MB方案分化的细胞中，两种iPSC系都没有矿物质吸收。统计数据基于方差分析和Tukey多重比较事后检验(n=3个井重复，****p < 0.0001)。

　　为了进一步评估整个分化过程中的基因表达，使用干性标记(图8A)、破骨细胞前体标记(图8B)和破骨细胞标记(图8C、D、E、F)进行qRT-PCR(图8)。在所有组中，POU5F1 (Oct3/4)的表达在整个分化过程中均显著降低(图8A)。然而，可以注意到的是，与MB分化相比，EB分化的iPSCs表现出更大的下降。在EB分化过程中，从中胚层到造血阶段，CSF1R (M-CSFR)显著增加(图8B)。根据MB方案分化的pbmc衍生的iPSCs未显示CSF1R增加。成纤维细胞衍生的iPSC细胞系中CSF1R的Ct值低于检测阈值。根据EB方案进行分化时，OC标记物RANK(图8C)和NFATC1(图8D)的表达在OC期较前造血期显著增加。在两个iPSC系中都观察到这种增加。此外，当使用EB方案进行分化时，与吸收活性、CA2(图8E)和MMP9(图8F)相关的标志物在OC期也显著升高。

　　图8

　　

　　多能干细胞在分化过程中的相对基因表达。在独立于iPSC系的胚胎体(EB)分化方案B中，POU5F1基因表达在中胚层至造血期均显著降低(A)， CSF1R基因表达在中胚层后较造血期显著升高。基于单层(MB)的分化要么没有显著增加，要么初始Ct值低于检测阈值。在两种iPSC系中，破骨细胞标记均显示EB协议显著增加，而MB分化没有产生足够的RNA进行分析(C-F)。统计学基于Holm-?ídák方法的多次比较(n=3个重复，除了POU5F1: pbmc来源的iPSC EB分化的OC期和pbmc来源的iPSC MB分化的造血期，以及CA2:成纤维细胞来源的iPSC MB分化的中胚层期，所有重复都接近，而一个重复低于检测阈值，*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001)。

　　已经发表了几种造血分化方案。然而，目前尚不清楚哪种方案或分化方法有利于破骨细胞的发生。在这里，我们使用来自不同组织来源的iPSC系比较EB和MB分化方案。我们发现EB分化产生真正的破骨细胞，与所使用的iPSC系的组织来源无关，而MB分化导致早期造血细胞，随后不会分化为oc。

　　多能干细胞向OCs的分化需要一系列复杂的过程。虽然整个分化过程可以分为中胚层、造血和OC分化三个主要步骤，但每个步骤都可以进一步细分为个体发生中概括的步骤。造血分化已被证明需要中胚层诱导、造血内皮规范、血管动脉化、内皮向造血过渡和造血成熟等阶段[40,45]。先前有报道称，EB和MB方法都在不同程度上概括了这些步骤[37,46,47,48,49,50,51,52]。

　　在EB形成过程中，多能性标记物的长时间表达也在其他地方被描述[41,53]，类似于EB和MB方案即使在造血分化后仍在细胞形成复合物中心保留ALP表达。

　　据报道，EB分化通过显示外胚层、中胚层和内胚层来模拟着床后发育的早期阶段[40]。因此，胚状体在三个胚层均有表达，但在不同组织来源的两种iPSC系中，胚状体的表达程度和空间组织存在差异。与EB分化方法相比，MB分化表现出相似的三胚层标记物的空间组织表达模式。

　　细胞形成复合物，无论是EB还是MB，都有可能影响和改变造血细胞的产生。这是通过细胞间相互作用、细胞外基质(ECM)相互作用和细胞利基细胞因子信号传导来实现的[53,54]。因此，正确的微环境似乎对成功的造血分化至关重要[53,55,56,57]。例如，Sturgeon等人表明，在中胚层发育过程中，Wnt -β-catenin的激活可以决定细胞是否会经历最终的造血程序[58,59,60]或原始程序。

　　研究表明，内源性Wnt -β-catenin信号在EB(或3D)细胞形成复合物中比在MB(或2D)细胞形成复合物中更活跃[61]。我们可以假设，由于单层的相对表面积比球体大，MB细胞形成复合物不能像EB复合物那样维持自身的微环境，并且更容易或依赖于外源细胞因子的浓度和组成。据报道，胚状体的分化结果也因其大小和质量的不同而变化很大[40]，这也可以用同样的假设来解释。

　　尽管胚状体大小存在差异，但EB分化产生的造血细胞比MB分化产生的造血细胞更多，细胞活力更高。尽管MB分化结合预制分化介质减少了工作量，并且显著提高了可用性，但该方法在每口井的iPSC菌落数量、菌落大小及其在井内的分布方面表现出更多的差异性。

　　然而，两种分化方法都产生了造血细胞。尽管在iPSC系之间可以观察到一些差异，但MB细胞在两种iPSC系中都显示出更大的CD34+群体，而EB分化的细胞群体则由大部分CD43+和CD45+细胞组成。CD43和CD45都是在CD34之后出现的，CD45与进行性髓细胞承袭有关[62,63,64]。此外，EB分化细胞中CD11b+和CD14+单核细胞的比例更大，表明与MB造血细胞相比，EB造血细胞总体上处于更下游的位置。这些发现与R?ssler等人的研究结果一致，他们发现使用EB分化的CD14+和CD11b+细胞的群体大小相似，尽管略高于我们的群体[31]。另一方面，Ruiz等人没有评估CD14和CD11b标记物的表达，但根据MB方案进行分化，在分化10天后，CD43+群体比CD45+群体更大[37]。这与我们的研究结果相当，显示MB方案的CD45+群体比EB方案小。然而，使用STEMdiff造血试剂盒根据MB方案进行造血细胞分化时，延长造血分化培养基的治疗时间可以增加CD45+的比例[37]。

　　虽然很少有研究关注OC前体的深入表型分析[65]，但传统观点认为，OC是一种能够产生共同髓系祖细胞(CMP)和共同淋巴系祖细胞(CLP)的多能祖细胞(MPP)。CMP又产生巨核细胞/红细胞祖细胞(MEP)和粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)。gmp可分化为粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和OCs[65,66,67,68,69,70]。gmp能够产生CD11b+和CD14+单核细胞，众所周知，它们能够分化为OCs[71,72,73,74,75]。然而，CD14?细胞[74,76]和CD11b?CD14?CD115+ (CD115

　　CSFR1/c-FMS)群体也被证明具有高破骨潜能[77]。CD14 -细胞是否必须经过CD14+阶段才能分化为OCs还有待观察。最近的研究表明，除了淋巴样细胞外，不仅gmp，多淋巴样祖细胞(MLP)也能产生巨噬细胞和树突状细胞，同时缺乏巨核细胞/红细胞潜能[67,78,79]。GMP或MLP下游的CD11b?CD34+c-KIT+FLT3+ il3r α高群被鉴定为常见的巨噬细胞、OC和树突状细胞祖细胞，其CSFR1 mRNA阳性，但在细胞表面未显示任何CSFR1的存在[65]。使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)对OC群体进行的轨迹分析显示，OC的分化路径始于CD14+阶段，随后是树突状细胞和巨噬细胞阶段，然后达到更活跃的OC类型，表达更高水平的Cathepsin K和v - atp酶亚基d2[80]。早期(c-Kit+、c-Fms+、Mac-1dull和RANK -)和晚期OC前体(c-Kit -、c-Fms+、Mac-1+和RANK+)已被描述[81,82]，它们在多种因素的驱动下向成熟OC发展[83,84,88,88,88,89]。最终，单个核OC与相邻的单个核OC融合。这是由树突状细胞特异性跨膜蛋白(DC-STAMP)、破骨细胞刺激跨膜蛋白(OC-STAMP)和syncytin-B等蛋白调控的[90,91,92]，形成一个大的多核细胞。这些成熟的OCs能够吸收矿物质和骨[93]，并且与吸收过程相关的蛋白质如v - atp酶亚基d2、碳酸酐酶2、Cathepsin K和MMP9的表达增加[68,80,94,95,96]。

　　我们发现，根据EB方案分化的iPSC在PBMC和成纤维细胞衍生的iPSC系中都产生了大的多核细胞。qRT-PCR结果显示，TNFRSF11A、NFATC1、CA2和MMP9的表达显著增加，支持它们作为oc的身份。最后，TRAP表达、Cathepsin K表达和矿物质吸收能力清楚地表明分化的多核细胞是真正的OCs。

　　在pbmc衍生的iPSC细胞系中，使用MB方法分化的iPSC仅产生非常有限数量的最多5个细胞核的多核细胞，而在成纤维细胞衍生的iPSC细胞系中，没有多核的星形细胞。根据MB协议分化的两种iPSC系均未表现出矿物再吸收能力。我们假设，由于与EB方法相比，MB分化过程产生了更早的HPCs，因此MB细胞可能没有在相同的分化时间跨度内达到OC阶段，而可能保持在早期阶段或侧轨迹，如巨噬细胞或树突状细胞。

　　EB或MB分化细胞均显示TRAP+单核细胞，可推定为单核OC或OC前体。然而，TRAP的表达并不是OCs所特有的，它也存在于免疫细胞中，如巨噬细胞和树突状细胞(dc)[97,98,99]。已发现异构体5b主要由OCs分泌[100]，可用于进一步定义单个核细胞。然而，单细胞方法，如scRNA-seq，可能为获得不同群体内亚群和分化轨迹的整体图景提供了最好的可能性[101]。

　　在细胞生长方面，观察到基于组织来源的iPSC系的差异，因为成纤维细胞衍生的iPSC在繁殖过程中表现出更高的增殖率(数据未显示)。成纤维细胞衍生的iPSCs也比pbmc衍生的iPSCs释放出更多的造血细胞。然而，这两种细胞系都可以独立于其组织来源成功分化为OCs。这与iPSC分化潜力在很大程度上与细胞类型来源无关的研究一致[6,102]，而微小的差异归因于表观遗传记忆即使在重编程为iPSC后仍然存在[103,104,105]。pbmc来源的iPSCs平均每个胚状体释放2289个oc，而成纤维细胞来源的iPSCs平均每个胚状体释放5505个oc。

　　本研究的局限性主要在于使用市售分化试剂盒进行MB分化，因为细胞因子的组成和浓度没有完全公开，因此，本研究的发现可能部分归因于不同的细胞因子，而不仅仅是EB细胞形成复合物的3D形状大于MB细胞形成复合物的2D形状。然而，商业上可用的试剂盒有其一席之地，也需要对既定方法进行比较和验证。

　　关于可重复性，另一个限制在于使用FBS进行终末OC分化，这可能导致批次之间的差异[106]，因为我们的实验室已经注意到，使用不含外泌体的FBS与使用标准/未处理的FBS(未发表数据)在破骨细胞发生方面存在差异。从临床翻译的角度来看，需要一个完全定义的分化过程，而不使用FBS进行终末OC分化[107]。

　　最后，本研究的范围并没有揭示OCs分化的确切亚型。其他作者已经描述了许多不同亚型的OCs，如软骨细胞、牙髓细胞、中隔细胞和血管相关的OCs[108,109,110,111]。单细胞转录组学还可以为分化轨迹和细胞亚型提供更深入的了解。

　　本研究的结果表明，结合EB分化方法，OCs从iPSCs成功分化。相比之下，使用市售造血分化试剂盒的MB分化方法不能产生OCs。通过破骨细胞标志物的表达和矿物吸收活性的测定，证实了真正的OCs的存在。分化过程在中胚层诱导、造血分化和终末OC分化后持续进行评估，使用来自两个不同组织来源的iPSCs进行EB和MB方法的分化。在本研究中使用的PBMC和成纤维细胞来源的iPSC系之间，没有观察到OC分化的差异。

　　． 表S1。抗体的列表。

　　． 表S2。引物列表。

　　． 补充图S1。EB和MB分化中细胞形成复合物产生的造血细胞的数量和活力。与EB分化相比，PBMC和成纤维细胞衍生的细胞系在归一化到相同表面积后，MB分化的造血细胞产量显著降低(a)。成纤维细胞衍生的iPSCs比PBMC衍生的iPSCs产生更多的造血细胞。两种细胞系EB分化细胞的细胞活力均高于MB分化细胞(B) (n=3个技术重复)。

　　ccDownload: /内容/ pdf / 10.1186 / s13287 - 023 - 03547 - 6. - pdf